Einzelne Farbstoffmoleküle, die nur rund zehn Millionstel Millimeter voneinander entfernt sind, können jetzt mit einem neuen Nahfeldmikroskop erstmals optisch einzeln abgebildet werden. Wissenschaftler am Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried haben mit ihrem „Tip on Aperture“-Nahfeldmikroskop Lage und Orientierung einzelner fluoreszierender Farbstoffmoleküle bestimmt. Mit ihrer neuen Entwicklung erweitern die Forscher die Möglichkeiten der Fluoreszenzmikroskopie, mit der markierte Moleküle in der Molekular- und Zellbiologie untersucht werden.
Um biologische Strukturen im Detail beobachten und Rückschlüsse auf ihren Standort und ihre Funktion in einer Zelle beziehungsweise einem Organismus ziehen zu können, benötigt man immer leistungsfähigere Mikroskope. Eine von den Biophysikern am Max-Planck-Institut für Biochemie entwickelte hochauflösende Methode ist die optische Rasternahfeldmikroskopie, die auf der Lichtkonzentration an einer Spitze basiert.
Hierbei rastert eine feine Nadelspitze von nur wenigen Nanometern Durchmesser an ihrem Ende eine Oberfläche ab: Einerseits tastet diese Spitze durch Kraftwechselwirkung die Topographie der Probe ab, gleichzeitig aber wird Laserlicht über Linsen auf die Nadelspitze fokussiert, die das Licht an ihrem Ende noch weiter konzentriert. Mit dieser filigranen Lichtsonde lassen sich dann optisch Details des Objekts in einer Größenordnung abbilden, die dem Radius der Nadelspitze entspricht.
Jetzt auch für biologische Proben geeignet
Während man heute die Nahfeldmikrokopie bereits erfolgreich in der Materialforschung einsetzt, gab es bei der Anwendung der Nahfeldmikroskopie auf biologische Strukturen bisher noch Probleme. So setzt man sehr häufig zur Untersuchung von Zellen und ihren Stoffwechselvorgängen fluoreszierende Farbstoffe ein, um beispielsweise Proteine und ihre Aktivität im normalen Mikroskop mit Licht bestimmter Wellenlänge sichtbar zu machen. Doch leider bleichen die Farbstoffe der Fluoreszenz-Markierung sehr schnell aus. Das trat insbesondere bei der auf Nadelspitzen beruhenden Nahfeldmikroskopie auf, da hier das eingestrahlte Laserlicht auch durch die besten Linsen nur auf einen Bereich gebündelt werden kann, der noch weit größer ist als der Spitzenradius.
Glasfaser mit Blende
Die Max-Planck-Wissenschaftler Heinrich Frey, Susanne Witt und Karin Felder haben nun unter Leitung von Reinhard Guckenberger eine neue Version der optischen Nahfeldtechnik entwickelt, bei der das Bleichproblem nicht mehr entscheidend ist: Hierbei wird die Spitze jetzt durch eine Glasfaser mit einer Apertur-Blende an deren Ende beleuchtet. Die Apertur begrenzt das Laserlicht auf einen kleinen Bereich um die Abtastspitze, so dass ein vorzeitiges Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe minimiert wird. Die Spitze selbst sorgt noch einmal für eine weitere Konzentration des Lichts an ihrem Ende. Mit dieser „Tip on Aperture“-Sonde (zu Deutsch: „Spitze auf Apertur-Blende“, kurz „TOA“) können die Wissenschaftler nun fluoreszenzmarkierte oder auch selbst fluoreszierende Moleküle, zum Beispiel an der Oberfläche von biologischen Strukturen, mit sehr hoher Auflösung erkennen.
Mit dem neuen TOA-Nahfeldmikroskop ist es den Martinsrieder Wissenschaftlern somit gelungen, die hervorragende Auflösung eines optischen Nahfeldmikroskops von bis zu zehn Nanometern mit der Fluoreszenzmarkierung einzelner Moleküle zu kombinieren. Dazu verknüpften die Forscher die Enden von DNS-Molekülen mit dem Farbstoff Cy-3, brachten die DNS auf einen Probenträger auf und rasterten sie mit der neuen TOA-Nahfeldmikroskop-Spitze ab. Dabei registrierten die Wissenschaftler gleichzeitig sowohl die Topographie der DNS-Moleküle als auch die Fluoreszenz der einzelnen Cy-3-Moleküle. Tatsächlich fand sich die Fluoreszenz ganz überwiegend an Enden der DNS. Sie trat für jedes Cy-3-Molekül in charakteristischen Mustern auf. Mit Hilfe eines einfachen Modells lassen sich daraus sowohl der genaue Ort (Genauigkeit: höher als ein Nanometer) als auch die räumliche Orientierung des Fluoreszenzfarbstoffs bestimmen.
Proteinkomplexe als Objekt
Die neuartige optische TOA-Nahfeldmikroskopie macht es jetzt möglich, einzeln präparierte biologische Strukturen, zum Beispiel Proteinkomplexe detailliert zu untersuchen. Auch können Molekülkomplexe direkt auf der Oberfläche von Zellen oder Zellorganellen dargestellt werden. Ziel dabei ist, die Funktion der Komplexe direkt zu beobachten. Dazu wollen die Biophysiker am Max-Planck-Institut für Biochemie ihr neues Mikroskop noch weiter optimieren: So sollen Untersuchungen klären, was die optimale Geometrie der Sonde ist und wie das Laserlicht im Einzelnen von der Apertur-Blende zum Spitzenende gelangt.
(MPG, 11.11.2004 – NPO)
