Wenn man die Aktivität neuronaler Schaltkreise im Gehirn beobachten will, so nutzte man bisher vor allem die elektrische Ableitung mit Mikroelektroden. Doch diese Methode stößt an ihre Grenzen, will man Zellaktivitäten an vielen Stellen im Gehirn gleichzeitig erfassen. Wissenschaftlern des Max-Planck-Instituts für medizinische Forschung in Heidelberg ist es jetzt erstmals gelungen, Nervenzellen im Gehrin einer Maus mit einer neuen opto-physiologischen Methode zu beobachten.
Diese beruht auf fluoreszierenden Kalziumindikator-Proteinen, deren Sequenz in das Genom der Mäuse eingebaut wird. Die leuchtenden Substanzen ermöglichen eine wesentlich höhere zeitliche und räumliche Auflösung als bisherige nicht-invasive Methoden, wie funktionelles Magnetresonanz-Imaging (fMPI) oder Positronen-Emissionstomographie (PET). In Kombination mit dem Zwei-Photonen-Imaging besteht jetzt die Möglichkeit, Kalzium-Signale an vielen Stellen im Nervengewebe und sogar innerhalb der Fortsätze einzelner Nervenzellen zu beobachten – in vitro und in vivo. Diese Methode könnte helfen zu verstehen, auf welche Weise einzelne Gene am Aufbau bzw. der erfahrungsabhängigen Veränderung von Schaltkreisen im Gehirn beteiligt sind.
Kalzium als Signalstoff
Der menschliche Körper besteht zu zwei Prozent aus Kalzium; wovon 99 Prozent in Knochen und Zähnen gebunden ist. Das restliche, in und zwischen den Zellen befindliche Kalzium ist an vielerlei zellulären Prozessen beteiligt, von der Transkription über die Signalverarbeitung bis hin zur Muskelkontraktion. Kalzium-basierte Signalverarbeitung wird meist von spannungsgesteuerten oder durch Botenstoffe aktivierten Ionenkanälen vermittelt, die sich in der Zellmembran oder den die Organellen umschließende Membranen befinden.
Um Informationen über unsere Umwelt zu verarbeiten, kodiert, kombiniert und interpretiert das Gehirn eine Vielzahl von Signalen mittels komplizierter, elektrischer Aktivitätsmuster, die über das Gehirn verteilt sind. Simultane Messungen der Aktivität an verschiedenen Orten im Gehirn (z.B. mit Hilfe von Elektroden) verschaffen uns wichtige Einblicke und tragen dazu bei, dieses neuronale Netzwerk zu verstehen. Doch elektrische Ableitungen sind weder dazu geeignet, die Aktivität in den feinen Fortsätzen einzelner Nervenzellen aufzulösen, noch biochemische (nicht-elektrische) Signale zu messen. Daher wenden sich heute viele Forscher optischen Verfahren zu, bei denen Änderungen in der Kalziumkonzentration als Maß für neuronale Aktivität aufgezeichnet werden können („Calcium imaging“).
Leuchtendes Kalzium im Mäusehirn
Mazahir Hasan und seine Kollegen am Max-Planck-Institut für medizinische Forschung haben transgene Mäuse geschaffen, in deren Gehirn fluoreszierenden Kalzium-Indikatorproteine exprimiert werden. Da die Gensequenz für diesen Indikator in das Genom der Mäuse integriert wurde, eröffnet sich die Möglichkeit, die Indikatoren mit Hilfe zelltypspezifischer Promotoren gezielt in bestimmten Arten von Neuronen zu exprimieren. Dies erlaubt den Forschern, die Aktivität einer bestimmten Population von Nervenzellen zu kartieren.
Um im lebenden Gewebe untersuchen zu können, wo das von einem bestimmten Gen kodierte Protein exprimiert wird, fügt man dem zu untersuchenden Gen die Sequenz für ein fluoreszierendes Protein hinzu. Fluoreszierende Kalzium-Indikatorproteine („fluorescent calcium indicator protein“ oder FCIPs) ändern ihre Fluoreszenz dann, wenn sie Kalzium binden. In den späten 1990er Jahren entwickelt, wurden FCIPs bisher erfolgreich in Würmern, Fruchtfliegen und Zebrafischen eingesetzt.
FCIP-Anzeige auch bei Mäusen erfolgreich
Die entscheidende Frage war jedoch, ob die FCIPs auch im lebenden Mäusehirngewebe Kalziumsignale anzuzeigen vermögen. Dazu stimulierten die Forscher Gehirnschnitte von Mäusen mit mittlerer bis hoher FCIP-Expression mit Reizen, von denen bekannt ist, dass sie zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration führen. Sie beobachteten, dass die FCIP-Fluoreszenz wie erwartet als Folge des Reizes schnell anstiegt. Auch in vivo konnten zum Beispiel durch Geruchsstimulation erhebliche Fluoreszenzänderungen ausgelöst werden.
Die Tatsache, dass „schnelle und robuste“ FCIP-Signale in lebenden Tieren (in vivo) bei sensorischer Stimulation gemessen werden konnten, zeigt, so die Wissenschaftler, dass FCIPs als Reporter die Aktivität neuronaler Populationen in lebenden Systemen anzeigen. Da die Indikatorproteine stabil exprimiert werden – auch 8-12 Wochen alte Mäuse zeigten FCIP-Expression -, eignen sie sich auch dann, wenn neuronale Aktivität über ausgedehnte Zeiträume beobachtet werden soll.
Noch müssen einige Fragen geklärt werden, so zum Beispiel, warum sich bisher nur mit dem Ptet-Promotor eine hohe FCIP-Expression im Gehirn erreichen lässt, oder warum nicht alle Neurone einer bestimmten Population das Protein exprimieren. Nichtsdestotrotz haben die Max-Planck-Forscher erfolgreich gezeigt, dass mit dem TET-System (mit dem ‚Ptet‘-promoter) eine stabile und funktionelle Expression von Kalziumindikatoren möglich ist. Mit dieser Methode werden Komplikationen invasiver Techniken, wie das Einbringen von Indikatorfarbstoffen durch einen chirurgischen Eingriff, vermieden.
Außerdem sind die gemessenen Signale leichter zu interpretieren, da die FCIP-exprimierenden Zellpopulationen bereits vorher bekannt sind. Die Methode eignet sich für lebende Tiere (in vivo); hier können FCIPs anzeigen, wo und wann Neurone aktiv sind. Und nicht zuletzt: FCIP-Mäuse können mit Mäusen gekreuzt werden, die Mutationen in für die Nervenzellaktivität wichtigen Genen tragen, und so klären helfen, welche Rolle diese Gene in neuronalen Netzwerk spielen.
(MPG, 16.06.2004 – NPO)
